大家好，我是你们的科研助手小V。上一期我们分享了“荧光定量PCR中的常见异常结果”，根据大家的反馈，今天我们将深入探讨一些更复杂的异常问题。
复孔间重复性差，应该怎么办？
复孔间重复性差的现象通常有两种表现形式：
1. CT值较高（如CT≥30）
这种情况下，复孔间的重复性差是正常现象。这种波动符合泊松分布的规律，当模板量较少时，模板与引物的偶然碰撞会导致每个孔的CT值存在较大差异。
解决办法：
若融解曲线无杂峰，且无模板阴性对照（NTC）在同一目标基因的△CT值大于3或5，可以认为CT值是准确的。可以增加更多复孔，选取重复性较好的CT值进行计算。
2. CT值较小（CT＜30）
这种情况通常与操作过程有关，可能是由加样误差或设备问题引起的。
排查建议：
可以从以下几个方面进行排查：
加样的准确度
移液器的精度
qPCR仪器是否需要重新校准
加样的准确度
避免使用小体积加样，以减少加样误差。建议将引物、SYBR Green Mix、ddH2O等溶液预先混合，并设置多个稀释梯度进行大体积加样。例如：原液cDNA可稀释5倍后，使用5μl进行加样，使用ddH2O补齐至20μl。
确保所有试剂充分混匀，特别是从-20℃冰箱中取出的试剂，必须完全融化并彻底混合。
移液器精度
定期校准移液器，建议每年进行一次。
使用配套的移液器枪头，避免因不匹配而造成吸液不准。
检查每次吸液时枪头内的液面高度是否一致，确保一致性。
qPCR仪的校准
qPCR仪通常每年需进行一次校准。
无模板对照（NTC）出现扩增，目标基因的CT值还能用吗？
NTC出现扩增现象通常有两种原因：
1. 融解曲线峰形不同
若NTC的融解曲线与目标基因的曲线峰形不重叠，通常是引物二聚体引起的，这不会影响目标基因CT值的准确性。
2. 融解曲线峰形重叠
若NTC的融解曲线与目标基因的峰形重叠，说明体系可能被气溶胶污染。目标基因的CT值是否可靠，需要进一步分析。
判定方法：
计算目标基因CT值与NTC的CT值差值（△CT）。
若△CT≥5，说明气溶胶污染对体系影响较小，可以忽略不计。
若△CT≥3，但不足5，也可以认为污染程度较低，CT值可以使用。
若△CT＜3，说明污染严重，CT值不可靠。
如何避免气溶胶污染？
更换新的SYBR Green Mix、引物和模板。
反应体系应尽量在超净台内操作，减少气溶胶污染的风险。
定期清洁超净台，使用稀释后的84消毒液擦拭工作台面，并对移液器进行酒精擦拭和紫外照射，消除污染。
加样时禁止在加样室打开qPCR产物的管盖。
为什么通过Tm值判断污染源？
使用相同的qPCR试剂扩增时，Tm值受扩增产物长度和GC含量的影响。
如果NTC现的扩增产物与目标基因扩增产物相似，且Tm值一致，融解曲线峰形重合，则可能是气溶胶污染。
如果NTC出现的扩增曲线是由引物二聚体造成的，这些二聚体通常较短，Tm值也较低，因此融解曲线峰形与目标基因有所不同。
CT值偏大该如何处理？
CT值较大的原因可能有多种，通常可以归为两类情况：
1. 前期实验正常，但本次实验所有基因CT值都偏大
检查RNA是否降解。如果RNA降解，qPCR扩增效率会显著降低，导致CT值偏大。
如何检测RNA是否降解：
使用1%琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。完整的RNA应该呈现28S、18S和5S带，其中28S条带亮度应是18S条带的两倍。若28S条带消失或泳道严重模糊，说明RNA降解严重，此时建议重新提取RNA进行实验。
2. 特定基因CT值偏大，其余基因正常
此时需要判定是由于基因扩增效率低，还是基因本身表达量低所致。
如何判定扩增效率是否低：
通过梯度稀释基因的扩增产物（至少三种梯度），然后进行qPCR，绘制标准曲线并计算扩增效率。
若扩增效率在90%-120%之间，且R2值接近0.99，则扩增效率符合要求，CT值偏大可能是由于目标基因的表达量较低。如果扩增效率不达标，则可能需要重新设计引物。
若扩增效率符合要求，但CT值依然较大，可能是因为目标基因的表达量过低，此时可以增加模板量，或者考虑使用探针法进行定量，后者的灵敏度更高。
今天我们深入分析了qPCR实验中一些常见的异常情况，并提供了相应的排查和解决方案。希望这些知识能帮助大家更好地进行实验，避免常见的错误。如果你在实验中遇到任何问题，随时欢迎与我们联系，诺唯赞将竭诚为您提供帮助！