Western Blot，即WB，乃蛋白质免疫印迹之术语。此技术乃基于抗原抗体间的特异性结合，用于半定量检测样品中的特定蛋白。在分子生物学、生物化学和免疫遗传学等领域，它是一种常用且经典的实验方法。
1. 实验原理
WB过程涉及将电泳分离的组分从凝胶转移到固相支持物（如NC膜或PVDF膜），再以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针进行检测。抗体作为探针，能够与固相支持物上的靶蛋白抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。此技术旨在鉴别并半定量分析细胞或提取物（即总蛋白混合物）中的特定蛋白，可识别蛋白的类型（如亚型、聚体、剪切体等）及表达量的变化。
2. 实验步骤详解
2.1 蛋白提取
此步骤需明确所研究目的蛋白的表达情况，考虑其在不同细胞或中的分布，以及可能的表达调控机制。可借助在线数据库如Uniport、NCBI和BIOGPS等资源，了解目的蛋白的特性，从而正确选择和处理样本。提取过程中需在冰上操作，以减少高温造成的蛋白降解，若涉及磷酸化蛋白检测，还需在提取液中加入磷酸酶抑制剂混合物。
2.2 蛋白浓度测定
取少量裂解液用于蛋白质定量分析，常用的方法包括凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、BCA法等。BCA法因其简便性和准确性而被广泛使用，其原理是在碱性环境下，蛋白质的肽链结构能与Cu²⁺反应生成络合物，进而与BCA试剂结合形成有颜色的复合物，通过测定光吸收值来确定蛋白质含量。
2.3 制备SDS-PAGE凝胶
SDS-PAGE通过SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质变性并带上负电荷，再通过PAGE（聚丙烯酰氨凝胶电泳）根据蛋白大小分离蛋白。需根据目标蛋白的分子量、表达位置和样本数量，确定凝胶的浓度、厚度和数量。
后续步骤...
后续步骤包括上样电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、洗涤、显影曝光等，每个步骤都需严格操作，确保转膜时间、一抗孵育时间等参数的准确性，以获得清晰的结果图。转膜时需注意胶和膜的放置顺序及方向，避免气泡产生影响结果。膜的选择及孔径大小也至关重要，需根据目标蛋白的大小选择合适的PVDF膜。
2.11 结果展示与参考文献
完成上述步骤后，即可得到WB结果图。通过文献如Lin JS等人的研究，可以进一步了解Co-Immunoprecipitation等与WB相关的技术与方法。
跟着伯小医的指导，从头到尾梳理一遍详细的实验流程，相信您能轻松掌握WB技术，获得令人赞叹的结果图。
参考文献:
此处可添加更多与WB相关的研究文献。