01 基础概念
质粒概述：质粒，作为一种存在于生物细胞内部的核酸分子，能够独立于寄主染色体自主复制，并在遗传上保持稳定。它常见于原核生物如细菌及某些真菌中。质粒大部分为DNA结构，少数为RNA类型。借助DNA载体，目的基因能够在细胞内部得到表达，进而达到研究目的。在实验中，人工改造的质粒常常作为载体之一，它具备以下几个核心特性：
1. 拥有一个或多个限制性内切酶的切割位点，便于目的基因的插入；
2. 带有如抗性基因、荧光基因等标记基因，这有利于后续的筛选过程；
3. 尺寸适中（通常小于10kb），便于转染操作。
选择合适的限制性内切酶构建载体时需注意：
1. 单酶切后载体容易自我连接，可能需要去磷酸化处理，并注意插入片段的方向性；
2. 双酶切时需留意同尾酶的自我连接问题。
02 构建过表达基因质粒流程
设计扩增表达基因的引物步骤：
1. 从NCBI Gene数据库中检索基因cDNA序列；
2. 分析CDS区序列的酶切位点，确保其与载体上的酶切位点不冲突；
3. 设计引物时，需包含CDS区的首尾序列，并在5’端添加酶切位点或（和）保护碱基（如上图所示）。
过表达基因质粒构建简述：
1. 通过PCR扩增出约1400bp的基因CDS区并进行胶回收；
2. 对PCR产物及载体进行双酶切并胶回收；
3. 使用T4连接酶（如Takara产品）将酶切后的片段连接过夜，之后进行转化和鉴定。
03 点突变质粒方法
1. 利用高保真酶（如PrimeSTAR Max DNA polymerase）进行定点突变；
通过PCR合成突变质粒，用DpnI消化模板质粒，随后进行转化培养，最终通过测序进行鉴定。
2. 采用无缝克隆技术进行定点突变：
PCR扩增出线性的突变载体，再通过无缝克隆技术连接成环状质粒，同样进行转化培养并测序鉴定。
04 CRISPR/Cas9质粒构建及效果鉴定
原理概述：
1. 选择切割区需注意PAM序列-NGG的存在；
2. sgRNA的20个碱基决定了其特异性；
3. 若需使Cas9失活，可引入D10A、H840A等突变。
sgRNA设计要点：
1. 设计需位于NGG序列之前，长度约20nt；
2. 确保GC含量在40-60%之间；
3. 最好以G碱基开始，并保证最后7个碱基的靶向性；
4. 靶向区域应尽量靠近基因编码区的ATG下游，首选第一或第二外显子。
CRISPR/Cas9质粒构建步骤：
1. 线性化载体；2. 使sgRNA双链结合；3. 将sgRNA与载体连接；4. 进行菌落PCR鉴定。
基因敲除效果鉴定方法：
1. 通过Western blot检测蛋白表达量的变化；
2. 使用双sgRNA进行敲除，两gRNA间隔约200-500bp。鉴定引物应设计在两个gRNA的外侧。