前言
聚合酶链式反应（PCR）作为一种分子生物学实验技术，主要用于扩增特定的DN段。实时荧光定量PCR（qPCR）作为第二代PCR技术，自1996年推出以来，在基因表达分析、病原微生物检测、动植物育种等多个研究领域得到了广泛应用。为了获得最理想的检测结果，qPCR的流程从样本采集、核酸提取、cDNA合成到上机检测，涉及到许多可以优化的参数。
1. 样本的采集与处理
要充分了解样本的不同分型和细胞分群，提前做好功课，尽可能覆盖所有的类型或细胞类型。采样需要严格规划，比如考虑材料的时效性和珍贵程度，样品要尽量新鲜，取样应尽可能快速。戴手套操作，防止污染。如果不马上提取核酸，需要存放在-80°C，并尽快处理。
2. 核酸的提取和检测
模板的质量直接影响到检测性能。有效的核酸提取是将RNA或DNA从其他混合物中分离出来的关键步骤。过程中需避免RNase或DNase污染，并对内源RNAse或DNAse进行有效抑制。对于基因的定量，必须使用高质量的RNA，这意味着需要非常仔细地检查RNA的浓度和质量。
3. cDNA合成
RNA质量对cDNA合成结果会产生重要影响。为了保证RNA的完整性，我们需要在冰上操作，使用RNase-free的枪头和离心管，减少操作时间等。在反应体系中加入RNase抑制剂也能有效防止RNA降解。
4. qPCR方法的建立
定量方法
qPCR的定量方法包括绝对定量和相对定量。绝对定量需要标准品构建标准曲线，而相对定量则在一个样本中比较目的基因与内参基因的表达变化。
荧光标记方法
荧光标记方法包括染料法和TaqMan荧光探针。染料法利用能与DNA双链结合的染料实现荧光增强，而TaqMan荧光探针则通过特异性的荧光探针与PCR扩增同步，实现荧光信号的累积与PCR产物形成的完全同步。
引物扩增效率验证
通过制作一系列不同浓度的标准样品，采用标准qPCR程序进行扩增，获得Cq值，并绘制标准曲线，评估PCR扩增效率。扩增效率应在90%-110%之间。
反应体系优化
反应体系的优化包括选择合适的耗材和qPCR试剂，进行引物预实验确定特异性和最适浓度，配置合适的PCR反应体系浓度，测试引物最合适的退火温度等。同时设置对照组来监控实验体系或污染。
实时荧光定量PCR常见问题分析
在qPCR实验中可能会遇到各种问题，如可疑的扩增曲线、异常的荧光信号、扩增效率过高或过低以及重复性差等。这些问题可能由多种因素引起，包括引物设计、移液技术、试剂质量、样品处理等。需要进行细致的实验设计和严格的操作流程来避免这些问题。
Cielo™实时荧光定量PCR系统
Cielo™实时荧光定量PCR系统是一款强大的qPCR系统，具有数据可靠性高、应用灵活、流程智能化和在线便捷性等特点。该系统能够提供多种qPCR应用分析，帮助用户更高效地进行实验和分析。