实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增过程中，利用荧光化学物质实时监测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。
该方法通过内参或外参法对特定DNA序列进行定量分析，以准确评估待测样品中的DNA含量。在QPCR反应体系中，过量添加SYBR荧光染料，该染料能够特异性地掺入DNA双链并发出荧光信号，未掺入链中的染料分子则不会发出荧光，从而确保荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。
在Real-time PCR中，模板的定量策略分为相对定量和绝对定量两种。
相对定量用于比较两个或多个不同样品中靶基因量的差异，得到的数据表示目的基因在各样本中的相对含量比例。这通常涉及比较实验样本中靶基因的Ct值与对照样本的Ct值，并使用实验样本中靶基因量与对照样本中靶基因量的比值或差异倍数来表示结果。
绝对定量则常用于精确计算初始模板中目的基因的浓度，如测定血液样品中的病毒颗粒数（DNA或RNA）或细胞中基因的拷贝数等。此方法所得数据为单个样本的定量描述，不依赖于其他样本。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数之间存在线，这种关系表现为标准曲线，绝对定量的检测即依据此标准曲线对未知样品进行定量。
一、实验方法
1. RNA提取
目前最常用的方法是trizol法，该方法具有强大的裂解能力，可迅速完整地裂解细胞或样本，有效抑制RNA的降解。市面上还有许多成品的RNA提取试剂盒，其原理与trizol法相似。
具体步骤如下：
- 取出冻存的或新鲜，称重后用液氮进行充分研磨；
- 加入1ml trizol或其他成品裂解液，充分混匀后震荡摇匀5-10分钟，以确保样本完全裂解；
- 在4℃下，以13000rpm的速度离心5分钟，然后吸取上清液转移至新的1.5ml离心管中；
- 加入预冷的氯仿，剧烈震荡30秒至60秒后静置5-10分钟，再进行4℃离心；
- 此时离心管中的液体分为三层，需吸取最上层的水溶液并转移至新的离心管中；
- 加入等体积的异丙醇，充分混匀后静置5-10分钟再进行4℃离心；
- 去除上清液，对管底的白色沉淀加入预冷的75%乙醇进行混匀清洗，然后进行4℃离心并去除上清液；
- 吹干沉淀后加入DEPC水溶液，测量浓度，并在-80℃下保存。
3. RNA浓度测量
通常使用nanodrop设备进行测量，观察260/280的比值应在1.8至2之间；也可进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现明显的拖带则可能表示RNA降解。
4. 反转录
RNA本身不能作为PCR反应的模板，需先将其反转录为cDNA再进行QPCR检测。通常根据RNA浓度，固定取样3ug/5ug的RNA进行反转录，加入反转录试剂盒中的配套试剂，并在特定温度下进行反应。反应得到的cDNA稀释至相同倍数后，在-80℃下保存。
5. 实时荧光定量PCR检测
在进行PCR上机检测时，通常认为相同RNA量反转录得到的cDNA不需要调整浓度，取相同体积的cDNA进行检测，一般取2-4ul即可。若为绝对定量检测，需增加标准品；若为常规mRNA检测，可选择actin或GAPDH作为内参；若检测特定的micRNA等，则常规使用U6作为内参。