前言
在科学实验的严谨性中，我们时常自问，是否进行了有效的对照实验？特别是在荧光定量PCR实验中，正确的对照设置对于结果的解读至关重要。
在荧光定量PCR的实践中，遇到曲线异常或无曲线的情况，我们首要的任务是分析阳性对照和阴性对照的扩增情况。这正突显了实验中设置对照的重要性。
荧光定量PCR实验流程繁复，从样品采集到结果读取，每一步都需精心操作。为了提高结果的精确度，我们通常通过设置各种对照来监控检测的各个环节。
阴性对照的重要性
荧光定量PCR的高灵敏度使其对实验室污染极为敏感，而阴性对照正是监控和发现污染的有效手段。
无模板对照（NTC）
在NTC中，我们使用水代替荧光定量PCR反应中的核酸，其他试剂按比例正常加入。正常情况下，NTC孔不会扩增。若出现扩增，则可能预示着体系中存在污染或SYBR Green实验中引物二聚体的形成。
阴性样本对照
阴性样本对照指的是不含有目的基因或靶序列的样本，也可以是样本保存液。它与含有目的基因的样本一同经过核酸提取等过程。若出现扩增，则提示实验过程中可能存在污染。
无逆转录酶对照
在PCR实验中，确保反应体系的纯净与准确至关重要。
阳性对照的必要性
阳性对照能排除假阴性结果，若检测出的样本结果不是阳性，则提示我们实验存在某些不可靠因素。
阳性样本对照
阳性内对照除了能一定程度上反映核酸提取效率外，还可用于评估提取流程中对核酸释放的效率。为了更准确地反映提取效率，我们可以选择已知阳性的样本进行后续的RT-PCR，并通过Ct值来评估实验流程。
内参基因的应用
内参基因能反映样本本身的质量，如拭子是否有效取样、RNA在运输和保存过程中是否有严重降解等。选择内参基因时，需根据样本类型和实验处理方式进行评估和选择。
扩增对照的监控作用
扩增对照可用于监控荧光定量PCR体系是否正常。使用含有扩增片段的质粒、假病毒或DNA/cDNA作为扩增阳性对照，若其未扩增或Ct值异常，则可能是定量PCR体系存在问题。
内部阳性对照的设立
若需全面监控每一份样本的实验过程，可在提取前在每个样本中加入一段外源DNA或RNA。这样在定量PCR时，我们可以同时检测目的基因和该段序列，从而评估样品的核酸富集和扩增效率。
通过合理设置和运用各种对照，我们能够更准确地解读荧光定量PCR实验结果，确保实验的可靠性与有效性。