对于那些在分子实验领域摸爬滚打的研究者们，他们深知，想要高效且高质量地完成实验并非易事。有时候，一个月内完成100个克隆已是常态，没有几把刷子是行不通的。若是遇上特别棘手的稀有基因，耗费数周的时间也是家常便饭。接下来，我将与大家分享一些关于载体构建的经验，希望能助你一臂之力，早日成为科研达人。
1. 做好准备，赢得胜利的先机
俗话说：“磨刀不误砍柴工”。在开始构建之前，先选对工具能让你事半功倍。我向大家推荐oligo软件和DNAstar软件。Oligo软件常用于引物设计和酶切位点分析，而DNAstar软件则是一款全面且强大的生物医学软件，用于DNA和蛋白质序列分析、重叠群拼接和基因工程管理。
小知识分享：曾经听说过一个实验室的故事。一位医学生物背景的学者尝试将一个质粒上的基因插入到另一个质粒中。在面临困境时，他若能事先查询合适的酶切位点或进行改造质粒的操作，任务便能轻松解决。但遗憾的是，他并未这样做，而是选择了笨拙的PCR引物设计方法去进行PCR扩增。结果不仅中间出现了突变，还耗费了大量时间和金钱去反复测序和试验。
2. 巧妙设计引物，细节决定成败
设计引物时，看懂质粒图谱是关键。以PEGFP-C1和PEGFP-N1为例，选择N1质粒时，需确保下游引物中不包含中止密码子，否则可能导致融合蛋白无法表达；而C1质粒则需注意阅读框是否正确，否则同样会导致失败。
- 设计酶切位点时，建议加入保护碱基。
- 酶切位点设计原则应遵循：优先使用粘性末端，若不行则考虑常用平端酶如EcoRV和SnaB1等。如有长远打算，可以设计多个酶切位点以备后用。
- KOZAK序列的问题不容忽视。很多质粒未提供KOZAK序列，这需要在设计引物时自行加入。
- 合理利用Gene Overlap技术。例如，若想加入flag标签、his标签等，可利用三引物进行overlap反应来避免额外的构建步骤。
- 引物长度可以适度增长，尤其是在GC比高的序列中。但是请注意，对于高GC序列的克隆，使用同尾酶策略（如Bgl2和BamH1）或平端连接可能是更稳妥的选择。
3. 高效PCR扩增技术
当没有现成质粒可供酶切时，PCR是首选且便捷的方法。目前市面上有众多PCR酶可供选择，正常情况下的高保真taq酶能满足大部分需求。然而对于难PCR的高GC基因，可以考虑更换PCR酶并添加DMSO、甘油等辅助试剂。
4. 精准酶切操作
强烈推荐使用NEB的内切酶。我曾有一次使用其他品牌的酶进行酶切过夜，结果质粒被切碎。而使用NEB的酶即使酶切时间长达72小时也能保持完好无损。TAKARA的酶也是一个不错的选择。
5. 优化连接反应
NEB的T4连接酶是连接操作中的得力助手。但请注意其Buffer中包含ATP，反复冻融会导致ATP失活。因此建议将Buffer分装后一次性使用。
6. 精炼转化技术
按照SOP操作转化步骤即可。我发现实验室使用takara的竞争性细胞虽然价格高但效率高得多。请注意在操作中避免出现一些小错误，比如使用了带有kana的LB培养基而混淆了转化效果。
7. 精确鉴定
菌液PCR是快速鉴定的好方法。要想避免假阳性结果，关键在于引物设计需同时覆盖载体和插入片段。菌液PCR不仅简单快速，而且准确可靠。