01 什么是qPCR
在分子生物学领域中，定量聚合酶链式反应（qPCR）以其高精确性和准确性而独树一帜，并极大地推动了生物医学研究的进步。该技术主要通过DNA聚合酶催化DNA的补充过程，将新标记序列加至短的单链DN段上，即引物的3'-OH断裂。这一系列反应在配备有荧光检测设备的特制热循环仪内进行，通过测量荧光信号强度与预定的参考值相比较，实现DNA含量的相对或绝对定量。
02 qPCR的常见应用
实时监测、高灵敏度和特异性使得qPCR在各种应用中具有不可估量的价值。
主要应用于：
- 基因表达谱分析
- 病原体精确检测
- 遗传变异深入研究
- 环境质量监控
- 临床诊断与治疗
03 qPCR的工作原理详解
典型的qPCR反应从含有DNA聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸酯（dNTP）、引物、染料或报告基因及模板DNA的混合液开始。在特定的温度和环境下，这些成分协同作用，完成DNA的定量扩增。
04 qPCR的关键步骤详述
变性阶段：在高温环境中（如94至98°C），双链DNA被解开成单链。
初步阶段：在稍低的温度（约50至70°C）下，引物与特定的模板DNA目标区域结合。
延伸阶段：在适宜的温度（如68-72°C）下，DNA聚合酶通过添加核苷酸到引物中，产生两条互补的DNA链。
定量完成阶段：每轮DNA补充时，利用荧光计测量并记录荧光信号，以实现DNA的定量分析。
05 qPCR检测方法概览
常见的qPCR检测方法包括DNA插层染料法、水解探针法、分子信标法和LNA探针法等。
06 引物设计的关键因素解析
设计qPCR引物时，需注意以下几点：引物长度宜在15至30个碱基对之间，针对70至200个碱基对的目标序列进行高效互补；选用的正反引物应有接近的熔解温度（Tm），理想目标温度为60至65°C；引物的3'端应富含GC，以提高模板结合效率和熔解温度。引物的GC含量应控制在40%至60%之间，以保证梯度、稳定性以及梯度效率的最优化；设定的退火温度应比引物的Tm低约5°C，以减少非极化的可能性。
07 常见问题及解决方案
问题1：qPCR扩增效率低
问题原因：
- 试剂和反应体系问题：可能是试剂降解或反应体系加液量不足。
- 设计问题：引物和标志设计存在缺陷。
解决方法：
- 确保所使用的试剂质量良好，并按照标准程序正确加样。
- 重新设计引物和标记，使用专业软件进行验证和优化。
问题2：结果出现假阳性功能
问题原因：
- 试剂和反应体系污染或镁离子浓度、引物浓度过高等。
- 引物设计存在缺陷，可能导致引物间的二聚体和发夹结构形成。
解决方法：