进行PCR实验的朋友们都知道，前期验证引物探针性能和确定最佳反应条件是确保实验顺利进行的关键步骤。在PCR的众多环节中，扩增效率的评估是一项极其重要的工作。扩增效率是反映PCR检测性能的重要指标之一，同时也是进行定量分析计算结果时必不可少的参数。接下来，让我们详细探讨一下这个话题。
扩增效率是什么
PCR是一种在体外对DNA进行扩增的技术，通常包含30至50个循环周期。在每个循环中，目标DNA分子的拷贝数最多可增加一倍。但实际上，一个DNA分子在单个扩增循环后被成功复制的概率，即扩增效率E，是小于1的。PCR的特点是反应初期目标DNA分子呈指数增长，此时的扩增效率接近于1；但随着反应组分的消耗、聚合酶活性的降低或二者的共同作用，扩增效率会逐渐下降直至停止。无论是用于定量DNA分子的初始量还是计算表达量的差异，都需要对PCR扩增效率进行精确的评估。
如何评估扩增效率
标准曲线是评估PCR扩增效率最为可靠和稳定的方法之一，被广大研究者所采纳。该方法涉及制备一系列样品来控制目标模板的相对数量。这些样品通常是通过连续稀释浓缩的原液得到，最常用的稀释方式为10倍稀释。使用标准qPCR程序对一系列稀释样品进行扩增，获得Cq值。然后根据各样品浓度及其相应的Cq值绘制标准曲线，得到线性方程Cq=-klgX0+b，进而计算出扩增效率E=10^(-1/k)-1。在进行qPCR定量分析时，扩增效率的范围应维持在90%至110%之间（3.6>k>3.1）。
影响扩增效率的关键要素
PCR的效率受到多种因素的影响。首先是检测性能，这取决于引物、模板的序列和结构。模板的二级结构和分子间的相互作用都可能降低PCR效率。其次是样品基质，其中可能含有来自样品的抑制剂和其他干扰物质，或来自上游加工步骤的试剂。检测样品是否存在抑制作用，可以使用RNA或DNA Spikes方法进行检测。所用试剂及其浓度、竞争性反应、qPCR仪器的特性以及技术重复的次数等也都是影响PCR扩增效率的重要因素。
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扩增效率不佳的可能原因及应对措施
当扩增效率表现不佳时，可能的原因包括移液器校准不良、移液技术差、不正确的稀释导致标准曲线出错、染料浓度低荧光或仪器未校准染料、引物设计不佳或扩增子具有二级结构、标准曲线动态范围太小、Taq酶无活性或活性降低以及样品抑制等。而对于过高的扩增效率，可能的原因则包括移液器校准问题、引物二聚体或非特异性扩增、标准曲线动态范围不足、基因组DNA污染（仅限RNA模板未进行DNase I处理或DNase I消化不完全）等。在遇到这些问题时，需要仔细检查实验操作和设备校准，以及优化引物设计和实验条件。