简述
PCR技术主要用于扩增特定DN段，同时避免产生非特异性副产物。在物理和化学因子的调整中，每一个因子均可被改变以增强PCR产物的生成，并提高其特异性和敏感性。要获得理想的结果，引物设计是关键环节。即使其他所有参数都达到最优，若引物设计不当，仍可能导致非特异性扩增、引物二聚体形成，最终导致PCR产物稀少或无产物。接下来我们将详细介绍PCR引物设计的一般原则。
引物长度的重要性
引物长度对反应的特异性、解链温度以及退火时间均有显著影响，从而影响PCR反应的成功与否。通常情况下，引物长度介于18至30个碱基对之间。引物过短可能导致非特异性扩增，而过长虽然能提高特异性，但也可能增加二级结构（如发夹结构）的形成概率。
把握引物的解链温度
PCR反应的特异性很大程度上依赖于引物的解链温度（Tm值）。多数PCR反应的最佳解链温度应在55至60℃之间。在无其他不稳定因素的情况下，引物的Tm值取决于其长度、序列组成和浓度。离子强度的影响可以忽略不计，因为不同的PCR反应盐浓度变化不大。为确保PCR反应的高效进行，所有引物的解链温度应尽可能接近，且引物间的Tm差应控制在2至3℃以内。
退火温度的调整
退火温度应略低于引物的解链温度。仅凭这一原则确定的退火温度可能并非最优，需要通过实验来确定最佳温度。利用梯度热循环仪可以轻松实现这一目的。
复制子的解链温度考量
在考虑引物解链温度的也要确保产物的解链温度足够低，以便在92℃时能够完全解链。通常，100至600碱基对的片段可实现有效扩增。这一参数有助于提高PCR效率，但并非成功PCR的必要条件。
二级结构的预防
设计引物时，需考虑二级结构的影响。带有同源序列的引子可能形成发夹结构或引物二聚体。在PCR反应中，引物浓度远高于模板浓度，因此引物间退火的可能性更大。为避免出现二级结构，应选择GC含量适中（约50%）、四种碱基分布均匀的引物。
重复序列的避免
同一碱基或几个核苷酸的重复也应尽量避免。不同的重复模式对PCR反应的影响不同，简单的重复可能导致引物二级结合位点形成，引发非特异性扩增；而反向重复可能引起发夹结构的形成，降低PCR效率。
GC夹的运用
在引物的3'端添加G或C残基可以提高引物的扩增效率，这被称为GC夹。这一做法有助于增强引物与模板的结合稳定性，通过形成更稳定的氢键来促进3'端的正确结合。
非目标同源的筛查
利用AST程序对引物序列进行筛查，以确认目标DNA的其他区域内是否存在非目标同源序列。若存在非目标同源序列，则可能产生非特异性片段，降低PCR的特异性。