HBV感染对人类健康构成严峻挑战。在，有超过8000万慢性乙型肝炎患者，其中超过三分之一的人急需治疗，目前接受治疗的患者仅占少数。这一严峻形势与WHO的目标相去甚远。慢性乙型肝炎难以根治的主要原因在于，当前的治疗方式并未直接针对乙肝病毒的遗传基因组，即cccDNA（共价闭合圈DNA）和整合HBV DNA。
关于单一gRNA的研究已经取得了一定的进展。当谈及双gRNA时，其潜力更是令人瞩目。当两种不同的gRNA被递送到细胞中时，它们各自引导Cas9蛋白结合并在不同位点剪切cccDNA。如果这种剪切同时发生，两个剪切位点之间的片段将会被删除，形成的更小环状DNA不再能支持HBV DNA的复制。
Wangjie等通过实验研究，尝试不同的双gRNA组合，发现当应用双gRNA时，HBeAg和HBsAg浓度水平均大幅下降，且双gRNA的表现优于单一gRNA。在所有组合中，gRNA5+gRNA12组合效果尤其显著，通过检测几乎没有检测到全基因片段，这意味着两个剪切位点之间的片段已经被删除，几乎所有的cccDNA都被了。
为了更好地清除cccDNA，Wangjie等进一步研究了gRNA-miRNA-gRNA三联体。该三联体在表达Cas9蛋白的利用细胞内的机制释放pre-miR-HBV和gRNA，形成成熟的HBV特异性miRNA，从而阻滞HBV的转录和翻译。被释放的gRNA与cas9蛋白结合，有同样靶序列的cccDNA或整合HBV DNA。
相关动物实验的结果令人振奋。在小鼠模型中，通过注射三联体，几乎检测不到HBsAg，肝切片中也几乎没有发现HBcAg蛋白，这表明cccDNA已经被完全，CRISPR/Cas9系统能有效HBV DNA。
Chen等的研究也证实了外泌体中存在完整的gRNA和Cas9蛋白。免疫荧光染色进一步表明Cas9蛋白可以进入外泌体中。这些研究成果为开发新的治疗方法提供了重要依据。
参考文献：
专家简介：鲁凤民教授是北京大学基础医学院病原生物学系及北京大学感染病中心的专家。他的研究方向包括乙型肝炎病毒及相关肝病、肝癌的发病机制和诊断标志物的研发等。他在此领域取得了丰富的成果，并承担了多项级科研项目。他的研究论文被广泛引用，并获得了多项专利授权。