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内参蛋白的选择与验证在Western blot实验中的重要性如何体现？究竟哪一种内参蛋白更为可靠？让我们一起探讨。
Western blot是分子生物学中检测特定蛋白质的常见手段。为确保目标蛋白的可比性，实验过程中需控制上样量，并选择一个普遍存在的恒定蛋白作为内参。那么如何选择及确定内参与其上样量呢？让我们进一步了解。
常用的内参抗体及其分子量定位情况各异。例如，当总蛋白上样量超过一定范围时，传统的内参蛋白如β-Actin和GAPDH可能会出现灵敏度不足的问题。合适的内参选择上样量是一个关键考量。一般而言，内参的理想上样量约为5μg，而目标蛋白的上样量则在10-20μg之间。
研究中发现，使用β-Actin和GAPDH作为内参在某些情况下可能存在争议。在某些细胞裂解液的上样过程中，即使总蛋白质超过一定量，这些内参的条带强度也几乎无变化。这种现象使得数据标准化受到质疑，特别是在每个目标蛋白条带都需要与内参对照的审稿要求下。